G-418 disulfate
溶解性：
溶于水（50mg/ml)
儲(chǔ)備液保存：
一：G418儲(chǔ)存液的配制（50 mg/mL，活性濃度）
1、活力單位的換算：根據(jù)此公式進(jìn)行換算：（1000/A0）×A1=A2，其中A0是G418的活力值（Potency），因批次而異。可見批次對(duì)應(yīng)的質(zhì)檢報(bào)告，或者瓶子上的標(biāo)簽。A1是想配制的活性G418濃度。A2是實(shí)際稱重的粉末與體積比濃度。
比如若所用批次的G418 活力值為：500 μg/mg，要配制50 mg/mL的G418活性濃度，則實(shí)際要配制的粉末濃度為1000/500×50 mg/mL=100 mg/mL。
2、除菌和保存根據(jù)上述換算得到的實(shí)際粉末稱重量，加入10 mL無菌去離子水內(nèi)使其完全溶解。之后使用此濾器過濾，除菌后分裝成單次使用的小量放到-20℃凍存，1年穩(wěn)定。
【注】：①不要對(duì)混濁的溶液進(jìn)行過濾，因?yàn)榛鞚岬娜芤阂馕吨赐耆芙猓^濾過程中會(huì)造成藥物損失，降低終液的活性。②不建議使用液體培養(yǎng)基，NaCl,磷酸鹽溶液或者有機(jī)溶劑來制備儲(chǔ)存液。
二：常用篩選濃度
一般來說，剛開始篩選轉(zhuǎn)化子需要高濃度的G418，并用一個(gè)較低濃度的G418用于維持培養(yǎng)。生長條件，細(xì)胞類型和其他的環(huán)境因素都可能影響G418的用量，因此第一次使用的實(shí)驗(yàn)體系建議通過殺滅曲線（kill curve），即劑量反應(yīng)性曲線，來確定最佳篩選濃度。
通常情況，哺乳動(dòng)物細(xì)胞篩選范圍200-2000 μg/mL；植物細(xì)胞：10-100 μg/mL；酵母細(xì)胞：500-1000 μg/mL；以下是一些細(xì)胞類型使用G418篩選使用的濃度，可做參考。
細(xì)胞類型 激活濃度 應(yīng)用
網(wǎng)柄菌屬 a) 10 μg/mL
b) 30 μg/mL a）培養(yǎng)在培養(yǎng)液中；
b）培養(yǎng)在凍干細(xì)菌上；
哺乳動(dòng)物 a) 400 -1000 μg/mL
b) 200 μg/mL a）用于篩選
b）用于維持生長
植物 a) 25-50 μg/mL
b) 10 μg/mL a）用于篩選
b）用于維持生長
酵母 a) 500 μg/mL
b) 125-200 μg/mL a）用于篩選
b）用于維持生長
細(xì)菌 8-16 μg/mL 用于篩選
三、殺滅曲線的建立
【注】：為了篩選得到穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞株，需要確定能夠殺死未轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的抗生素最低濃度，可通過建立殺滅曲線（劑量反應(yīng)曲線）來實(shí)現(xiàn)，至少選擇6個(gè)濃度。處理分裂期的細(xì)胞時(shí)G418的活性最強(qiáng)，因此在添加G418之前需要讓細(xì)胞培養(yǎng)一段時(shí)間。
1、第一天：未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞按照20-25%的細(xì)胞密度鋪在合適的培養(yǎng)板上，37℃，CO2培養(yǎng)過夜；
【注】：對(duì)于需要更高密度來檢測活力的細(xì)胞，可增加接種量。
2、根據(jù)細(xì)胞類型，設(shè)定合適范圍內(nèi)的濃度梯度。以哺乳動(dòng)物細(xì)胞為例，可設(shè)定0，50，100，200，400，800，1000 μg/mL。
3、第二天：去除舊的培養(yǎng)基，換用新鮮配制的含有相應(yīng)濃度藥物的培養(yǎng)基。每個(gè)濃度做三個(gè)平行孔。
4、接下來每3-4天更換新的含藥物培養(yǎng)基。
5、按照固定的周期（如每2天）進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)來確定阻止未轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長的恰當(dāng)濃度。選擇在理想的天數(shù)（通常是7-10天）內(nèi)能夠殺死絕大多數(shù)細(xì)胞的最低濃度為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選用的工作濃度。
四、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選
1、轉(zhuǎn)染48 h后，用含有適當(dāng)濃度的G418篩選培養(yǎng)基來傳代細(xì)胞（直接傳代或者稀釋后傳代）。
【注】：細(xì)胞處于活躍分裂狀態(tài)時(shí)抗生素的殺傷效果最好。則當(dāng)細(xì)胞過于稠密，其效率會(huì)降低。為了得到較好的篩選效果，最好將細(xì)胞稀釋至豐度不超過25%。
2、每隔3-4天更換含有藥物的篩選培養(yǎng)液。
3、篩選7天后觀察并評(píng)估細(xì)胞克隆（集落）的形成情況。集落的形成可能還需要一周或者更多的時(shí)間，這取決于宿主細(xì)胞類型，轉(zhuǎn)染，以及篩選效果。
4、挑取并轉(zhuǎn)移5-10個(gè)抗性克隆于35 mm細(xì)胞培養(yǎng)板，繼續(xù)用含藥物的篩選培養(yǎng)液維持培養(yǎng)7天。
5、之后更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)即可。
【注意事項(xiàng)】
1、本品不可高壓滅菌
2、G418不要和其他的抗生素/抗真菌劑（如青霉素/鏈霉素）共同使用，因?yàn)樗鼈兪荊418的競爭性抑制劑。其他的抗生素也會(huì)產(chǎn)生交叉活性。
3、配制G418溶液時(shí)，一定要根據(jù)G418批次不同的活力值（potency）來進(jìn)行換算，從而得到需要活性濃度的儲(chǔ)存液以及工作液。
4、G418加入培養(yǎng)體系中未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞有可能不會(huì)被殺死，原因在于藥物濃度過低，或者細(xì)胞密度過高。另外，快速分裂的細(xì)胞相對(duì)于緩慢增殖細(xì)胞，更容易被殺死。對(duì)照細(xì)胞（未轉(zhuǎn)染）可能抗生素添加5-7天后才能殺死，轉(zhuǎn)染細(xì)胞（抗性克隆子）的克隆需要10-14天形成。
5、即使加入殺死劑量的G418，細(xì)胞可能會(huì)繼續(xù)分裂2-3次。G418的藥效通常在2天后才變得明顯。
體外實(shí)驗(yàn)：
1、先將使用到的所有器具去除內(nèi)毒素和其它污染源，儀器表面、工作臺(tái)面消毒。
2、在分析天平上稱取G418粉末1.00 g，加20 mL 無菌水溶液溶解。
3、用專用的超濾濾膜過濾到去除內(nèi)毒素的容器中，然后分裝到 1.5 mL EP管中。
4、不建議使用螺旋蓋管子，容易污染。-20度保存，避光。為避免污染和失效，建議分裝成小規(guī)格的，如500 uL。
體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：
將生理鹽水加入產(chǎn)品，現(xiàn)配現(xiàn)用：30 mg/mL
體外研究：
G418濃度為1-300 microgram/ml時(shí)，抑制多種原核和真核生物。來自Tn5（編碼氨基糖苷3'-磷酸轉(zhuǎn)移酶，APT 3' II）的neo基因賦予G418抗性，通常用在實(shí)驗(yàn)室研究中用于篩選基因工程細(xì)胞。一般作用于細(xì)菌和藻類的濃度為5 mg/L或更低，篩選哺乳動(dòng)物細(xì)胞的濃度為400 mg/L，維持哺乳動(dòng)物細(xì)胞的濃度為200 mg/L。篩選耐藥株可能需要1周到長達(dá)3周。
體內(nèi)研究：
40 到 80 mg/kg劑量的G418連續(xù)處理三天，足以消除所有來自感染小鼠的未轉(zhuǎn)染的T. brucei brucei寄生蟲。
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：
Animal Models: 血液中含T. bruceibruceiGUTat 3.1和 T.
bruceibruceiGUTat 3.1/BBR3的亞致死量輻射的小鼠
Formulation: 溶于無菌水
Dosages: 10, 20, 30, 40, 50, 或 80 mg/kg
Administration: 腹腔注射
保存條件：
2-8℃ 避光
注意事項(xiàng)：
1、為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
2、以上信息僅做參考交流之用。